HPV-Tests

Studien-gestützte HPV-Tests mit Zulassung durch die amerikanische Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde FDA

Digene Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test (Qiagen)

Nachweis von:
• 13 Hochrisiko-HPV-Typen (high-risk, HR): 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 und 68
• 5 Niedrigrisiko-HPV-Typen (low-risk, LR) : 6, 11, 42, 43 und 44

Der Test weist eine Infektion von o.g. Hochrisiko- bzw. Niedrigrisiko-HPV-Typen nach. Es findet keine Typisierung der einzelnen HPV-Typen statt.

Nachweismethode:
Signalamplifikation
Durch die Hybridisierung mit synthetischen RNA-Sonden, die komplementär zu der Genomsequenz von 13 HR (high- risk, Hochrisiko)-HPV-Typen und 5 LR (low- risk, Niedrigrisiko)-HPV-Typen sind können diese 18 Typen nachgewiesen werden. Dabei laufen die Reaktionen für die Hochrisiko-HPV-Typen und die Niedrigrisiko-HPV-Typen getrennt ab. Über die Bildung spezifischer DNA-RNA-Hybride und deren Bindung an immobilisierte Antikörper kann eine Reaktion dieser Hybride mit Anti-Hybrid-Antikörpern stattfinden. Diese sind mit alkalischer Phosphatase markiert. Nach der Zugabe von Dioxetansubstrat kann die relative Lichtintensität des emittierenden Lichts gemessen werden. Diese relative Lichtintensität (relative light unit, RLU) ist proportional zur vorhandenen Ziel-DNA und stellt so ein semi-quantitatives Maß der Virusmenge dar.

Schwellenwert:
Der klinisch definierte Schwellenwert liegt bei 4500-8000 (Anzahl Kopien je Reaktion) abhängig vom HPV-Typ.
Der empfohlene Schwellenwert der FDA (Food and Drug Administration) liegt bei 1 pg HPV DNA pro 1 ml Probe (bei HPV 16: 5´000 Kopien), entsprechend einem Wert relativer Lichtintensität (RLU) von 1,0.

Kreuzreaktionen:
Es können bei den Hochrisiko-Proben Kreuzreaktionen mit mind. 12 anderen HPV-Typen (u.a. den Niedrigrisikotypen HPV 6 und 42) stattfinden.

Zulassung:
Der Hybrid Capture 2 High-Risk HPV DNA Test ist seit März 2003 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen.

Literatur:
Der Digene Hybrid Capture 2 ist der am längsten in Routineuntersuchungen und in größter Stückzahl eingesetzte Test, der in außerordentlich vielen Querschnittsstudien sowie in kontrollierten randomisierten prospektiven Studien seine herausragende Wertigkeit bewiesen hat (Arbyn et al.2006; Bulk et al.2007, Cuzick et al. 2006, Mayrand et al. 2007; Meijer et al. 2007, Ronco et al. 2006, Ronco et al. 2009).
 

Cervista™ HPV HR (Hologics)

Nachweis von:
• 14 Hochrisiko-HPV-Typen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68
Der Test weist eine Infektion von o.g. Hochrisiko-HPV-Typen nach. Es findet keine Typisierung der einzelnen HPV-Typen statt.

Nachweismethode:
Signalamplifikation
Der Cervista™ HPV HR detektiert HPV DNA durch Bildung von DNA Triplex–Strukturen.
Diese unnatürliche Struktur, die nur bei HPV-positiven Patienten entstehen kann, wird von einem Spaltungsenzym erkannt. Das bewirkt die Ablösung der überlappenden Struktur (5’ „flap“). Es entstehen entsprechend der vorliegenden Menge HPV-DNA sogenannte DNA-Triplex-Strukturen und eine ebenfalls entsprechende Zahl dieser „flaps“. In einer zweiten, simultan verlaufenden, Reaktion generieren die abgelösten „flaps“ mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) ein fluoreszierendes Signal. Dieses Signal wird verstärkt. Zur genaueren Bestimmung, ob eine Infektion mit HPV16 und/oder 18 vorliegt kann der Cervista™ HPV 16/18 durchgeführt werden.

Schwellenwert:
Die analytische Sensitivität variiert zwischen 1´250-7´500 Kopien je Reaktion, abhängig vom HPV-Typ. Die Ergebnisse der 3 durchgeführten Reaktionen werden je durch einen Kontrollwert (Negativkontrolle) geteilt. Ein positives Ergebnis wird angezeigt, wenn entweder der Quotient des Höchst- und Tiefstwertes der 3 durchgeführten Reaktionen bei ≥ 1.525 bzw. der Tiefstwert bei ≥1.93 liegt. Dabei handelt es sich um die klinisch relevante Schwelle zur Detektion von Gewebebefunden ≥CIN 2.

Kreuzreaktionen:

Eine Kreuzreaktion mit den HPV-Typen 67 und 70 kann stattfinden.

Zulassung:
Cervista HPV HR sowie Cervista HPV16/18 sind seit März 2009 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen.

Literatur:
Bartholomew et al. 2011, Day et al. 2009, Einstein et al. 2010, Harvey et al. 2009, Johnson et al. 2008.

cobas®-4800 system (Roche)

Nachweis von:
• 14 Hochrisiko-HPV-Typen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68
• Typisierung von HPV 16 und 18

Nachweismethode:
Realtime-PCR
Das cobas®-4800 system besteht aus zwei Komponenten: der cobas x 480-Einheit für die vollautomatisierte Nukleinsäure-Aufarbeitung mit PCR-Ansatz und dem Echtzeit PCR Analysesystem cobas z 480. Mittels Amplifikation der Ziel-DNA durch Anwendung einer Realtime-PCR und Nukleinsäurenhybridisierung können in einem einzigen Schritt oben genannte HR-HPV-Typen nachgewiesen werden. Eine Realtime-PCR kann die Zahl der Amplifikationsschritte während der Synthese erfassen und deshalb einen quantitativen Nachweis liefern. Über Fluoreszenz-Marker wird anwesende HPV-DNA oben genannter 14 Hochrisiko-Typen angezeigt. Dabei gibt es einen Farbstoff für die Typen 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 und 68. HPV 16 und 18 werden mit gesonderten Farbstoffen angezeigt. Dieses Zweikomponentensystem läuft größtenteils automatisiert ab, wodurch unter anderem das Kontaminationsrisiko deutlich gesenkt wird. Es besteht die Möglichkeit eine Probe wahlweise auf HR-HPV und/oder HPV 16, 18 zu testen.

Schwellenwert:
Der Schwellenwert ist für die Test-Positivität an die klinische Wertigkeit angepasst und mit dem des Hybrid Capture 2 vergleichbar. Der analytische Schwellenwert liegt jedoch, je nach HPV-Typ, bei 150- 2400 Kopien/ml.

Kreuzreaktionen:
Es können Kreuzreaktionen mit 22 anderen HPV-Typen sowie 83 Mikroorganismen ausgeschlossen werden.

Zulassung:
Das cobas®-4800 system ist seit April 2011 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen.

Literatur:
Castle et al. 2009, Castle et al. 2011, Heidemann et al 2011, Stoler et al 2011.

Dieser Test erfüllt die Kriterien der Guidelines nach Meijer et al. 2009 (Heidemann et al. 2011) und eignet sich damit zum HPV-Primärscreening.

APTIMA® HPV (gen-probe) Nachweis von E6/7 mRNA

Nachweis & Genotypisierung von:
• 14 Hochrisiko-HPV-Typen: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68

Nachweismethode:
Der Aptima® HPV Test beinhaltet 3 Schritte, die nacheinander in einem Reaktionsgefäß ablaufen. Zuerst werden die Zielmoleküle (HPV-mRNA) vom Lysat getrennt, an Mikropartikel gebunden und hybridisieren mit komplementären Fänger-Oligomeren, die wiederum an magnetische Mikropartikel gebunden sind. Diese Hybride werden an die Wand des Reaktionsröhrchens gezogen. Dieser Schritt wird als target capture (TC) bezeichnet.
Der zweite Schritt führt zur Vervielfältigung der Nukleinsäureproben. Die Transcription-Mediated Amplification (TMA) ermöglicht die Vervielfältigung sowohl von DNA- als auch von RNA-Proben. Die Reverse Transkriptase erzeugt dabei eine DNA-Kopie der Target-Sequenz. Die Kopie enthält eine Promotersequenz für die RNA-Polymerase, die im Anschluss mehrere Kopien des RNA-Amplikons vom Template der DNA-Kopie erzeugt. DIE TMA ist isothermal und das Amplifikationsprodukt eine RNA.
Der dritte Schritt dient dem Nachweis des Amplikons. Mit Hilfe des „Hybridization Protection Assay (HPA)“. Dabei wird eine, mit einem Acridiniumester markierte Sonde verwendet, die mit der komplementären Sequenz des Zielmoleküls hybridisiert. Über den Kontakt mit dem so genannten Detektions-Reagenz emittiert ein Lichtsignal, welches mit einem Luminometer gemessen werden kann. Die Messung erfolgt qualitativ. Als Einheiten werden relative Lichteinheiten (Relative Light Units, RLU) verwendet.
Schwellenwert:
Die analytische Sensitivität liegt bei 20-500 Kopien je Reaktion abhängig vom HPV-Typ. Der Schwellenwert für Testpositivität ist jedoch mit dem des HC2 Tests vergleichbar.

Kreuzreaktionen:
Kreuzreaktionen mit Niedrigrisiko-HPV-Typen, Bakterien, Hefe und Pilzen finden nicht statt.

Literatur:
Clad et al 2011, Monsonego et al 2011, Ratnam et al 2011.

Zulassung:
Der Aptima HPV Test ist seit Oktober 2011 durch die FDA U.S (Food and Drug Administration) zugelassen.

Weitere Informationen zur Zulassung finden Sie auf den Seiten der FDA